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摘 要 目的：建立冻干纤维蛋白原的无菌检查方法，并对该方法进行验证。方法：本研究依据中国药典2015版指导原则开展，采用薄膜过滤法，在3批供试品中验证。结果：采用该无菌检查方法检查冻干纤维蛋白原，3批供试品组均无菌生长，而阳性对照组生长良好。结论：该方法可靠，适用于冻干纤维蛋白原的无菌检查。
猪纤维蛋白黏合剂属于纤维蛋白类止血材料，注册分类是生物制品；它的止血原理是模拟人体内凝血的最后一步反应，但它并不依赖于机体自身的凝血成分，因此它对具有凝血功能障碍或正在服用抗凝药物的患者仍有理想止血效果[1-3]。猪纤维蛋白黏合剂由猪纤维蛋白原、猪凝血酶及相应溶解液组成。猪纤维蛋白原由健康猪混合血浆，经分离、提纯、病毒灭活（S/D灭活和干热灭活）、冻干等制成。
目前关于化学类药物等小分子药物的无菌检查法的方法学验证报道较多[4-5]，但生物制品的相关报道较少。相比于化学类药物，由于生物制品常见的原料来源如人源组织、动物、微生物等，且其生产加工过程较复杂，因此生物制品更容易受微生物的污染[6]，所以针对生物制品的无菌检查方法开发尤为重要，旨在保证药品的安全性。
本研究对冻干纤维蛋白原开发了无菌检查方法，采用薄膜过滤法[7]，并对该方法进行了方法学验证，最终建立了冻干纤维蛋白原成品的无菌检查法。
1 材料和方法
1.1 菌株与培养基
实验所用菌株为即用型定量菌株[8]，金黄色葡萄球菌MDC2180222A；大肠埃希菌MDC7180222A；枯草芽孢杆菌 MDC3180116A；生孢梭菌MDC6180116A；白色念珠菌MDC4180306A；黑曲霉MDC5180306A。以上菌株均为3代，全部购自浙江泰林生物技术股份有限公司。其冻干粉直接取商品配套溶液复溶，配制成浓度为每0.1 ml不超过100 cfu的菌悬液。
胰酪大豆胨琼脂培养基（批号20190314、20190325）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号20190323）和硫乙醇酸盐流体培养基（批号20190315、20190325、20190326、20190327），均购自上海博微生物科技有限公司；TSA平板（G90TSA171113-1）购自上海永昶医学诊断用品有限公司。
1.2 药品与试剂
纤维蛋白原冻干制剂（上海利康瑞生物工程有限公司，批号2019020、20190302、20190303），0.9% 氯化钠溶液（上海凌峰化学试剂有限公司，批号20190312）。
1.3 仪器
BHC-1300IIA2生物安全柜（苏州时金净化设备科技有限公司）；LRH-100生化培养箱（上海合恒仪器有限公司）；HTY-602集菌仪（杭州泰林生物技术设备有限公司）；XK97-A菌落计数器（邦西仪器科技（上海）有限公司）。
1.4 方法
1.4.1 菌液制备与培养基适用性试验
实验均采用定量菌株，按定量菌株要求分别配制好菌悬液，使每0.1 ml菌液浓度不超过100 cfu。
按照培养基说明书要求，配制好培养基。取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌菌各3支，分别接种于硫乙醇酸盐流体培养基；取枯草芽孢杆菌、黑曲霉菌、白色念珠菌各3支，分别接种于胰酪大豆胨琼脂培养基，培养5 天。另取同体积量的培养基，不接种以作为阴性对照，培养5天。观察菌落生长情况，进行菌落计数，取平均值计算比值。
1.4.2 方法适用性试验
1）试验组 取冻干纤维蛋白原成品20支，每支用0.9 %无菌氯化钠溶液按标示量进行复溶。按照薄膜过滤法过滤，用0.9%氯化钠缓冲液冲洗，每次100 ml，冲洗2次，在最后一次的冲洗液中分别加入小于100 cfu的6种试验菌0.1 ml，过滤。加硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基至滤筒内。在生物安全柜中接种，其中分别接种小于100 cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌于装有硫乙醇酸盐流体培养基，分别接种小于100 cfu的枯草芽孢杆菌、黑曲霉菌、白色念珠菌于胰酪大豆胨琼脂培养基。将接种了金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌的培养器放置于30~35 ℃ 培养箱，将接种了枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的培养器置于20~25 ℃ 培养箱，分别培养3~5天，观察各管内试验菌的生长情况。
2）阳性对照组 取相应培养基100 ml代替供试品，分别接种试验菌（不超过100 cfu）至对应的培养基，过滤，按试验组同法操作，作为阳性对照。培养条件同试验组，观察各管内试验菌的生长情况。
3）阴性对照组 取0.9 % 无菌氯化钠溶液过滤后，分别注入100 ml的硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基，培养条件同试验组，观察各管内试验菌的生长情况。
上述试验独立平行操作3次。
1.4.3 供试品无菌检查
3批供试品供试液的配制同方法适用性试验。每批供试品取硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基，分别接种供试液10 ml。另取一装有同体积培养基的容器，接入等量0.9 %无菌氯化钠溶液，作为阴性对照。供试品无菌检查同时，取硫乙醇酸盐流体培养基接入供试液10 ml，将金黄色葡萄球菌以小于100 cfu的浓度接种，置于30~35 ℃ 培养，以作为阳性对照。将金黄色葡萄球菌以小于100 cfu的浓度接种，培养不超过3天，观察细菌生长情况。
2 结果
2.1 培养基适用性
3次平行菌落计数试验结果表明，各菌种在相应培养基上菌落计数结果平行性好，菌落数均在30~100范围内，具有良好的稳定性，说明操作规范，所用培养基合格，此培养基可用于供试品的无菌检查。具体结果参见下表
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